生物體的生長發(fā)育、損傷應激、免疫應答，以及體內(nèi)細胞分化凋亡等一切生命活動由各種各樣的過程所調(diào)控。其中泛素化及其“逆過程”去泛素化就是重要的調(diào)控機制，它們在體內(nèi)形成動態(tài)平衡，并幾乎參與了所有的生命活動。由于這兩個過程與腫瘤、心血管等疾病的免疫與發(fā)病機制密切相關，近年來，已成為研究熱點與重要藥物的新靶標。

病原菌在與宿主長期的相互“斗爭”中，會分泌一些具有去泛素化酶活性的“壞蛋分子”，干擾宿主泛素化過程，降低宿主免疫能力并促進病原菌的“侵襲”。一直以來，探索新型去泛素化酶及其功能與作用機制，是科學家最為關注的話題。

近日，浙江大學生命科學研究院朱永群教授團隊在國際上首次發(fā)現(xiàn)了一個來源于名為“嗜肺軍團菌”的病原菌中特異地切割線性泛素鏈的全新去泛素化酶，并揭示了其在病原菌與宿主相互作用中的重要功能及機制。相關研究成果發(fā)表于《自然—微生物》雜志。

一個長期的科學疑問

在人、動植物等真核生物的細胞中廣泛存在著泛素分子，它們是“路標”，指示著需要被降解的蛋白質(zhì)或者發(fā)出特定的信號轉(zhuǎn)導方向。而泛素分子會通過泛素化過程，在泛素激活酶、泛素結(jié)合酶和泛素連接酶的依次催化下，會形成不同連接形式的多聚泛素鏈，包括異肽鍵連接的泛素鏈和泛素分子“首尾相連”的線性泛素鏈，參與調(diào)節(jié)信號通路。

“線性泛素鏈作用很重要，其擁有獨特的構(gòu)象，只能被一些特殊的蛋白識別，從而介導很多重要的信號通路調(diào)節(jié)，影響重要的生理過程，如細胞凋亡，胚胎發(fā)育、自噬等。”朱永群告訴《中國科學報》。

與此同時，真核細胞內(nèi)還存在著大量的去泛素化酶，與泛素化“針鋒相對”，它能夠切割泛素鏈，釋放泛素分子并在“有需要的地方”被循環(huán)利用，因此，去泛素化酶在信號轉(zhuǎn)導過程中發(fā)揮著關鍵的“調(diào)節(jié)器”作用。

已有研究表明，這些去泛素化酶主要是針對異肽鍵的泛素鏈，針對線性泛素鏈的就只有一個名為OTULIN的特異切割的去泛素化酶。

不過，對于“OTULIN”如何起作用，科學家們之間莫衷一是。

朱永群表示，OTULIN雖然能夠“切割”線性泛素鏈，但有人認為它直接具有去泛素化酶活性，有人認為它只是作為一個“調(diào)節(jié)分子”，催化一個特殊的泛素連接酶LUBAC活性，使其起作用。“兩種觀點分別發(fā)表在《自然》和《細胞》兩家頂級期刊上，爭議很大。”

闡明相關機制很重要，因為在病原菌與宿主的“斗爭”中，線性泛素鏈參與宿主免疫防御過程，具有很強的抑制細菌侵染的能力。朱永群進一步解釋道，細菌“入侵”宿主之時，會分泌大量的毒性效應蛋白，也就是“毒素”，毒素進入細胞便開始“鳩占鵲巢”，它作用于宿主細胞關鍵信號分子，改變宿主正常的信號通路，拮抗宿主免疫防御和促進病原菌侵染，從而順利“存活”。

過去的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多個具有去泛素化酶活性的效應蛋白，但全部都是切割異肽鍵連接的泛素鏈，“是否存在特異地切割線性泛素鏈的去泛素化酶效應蛋白?這是病原菌領域里長期以來存在著一個科學疑問。”朱永群說。

一個簡單新穎的實驗

“這個很難做。”朱永群坦承，病原菌不計其數(shù)，其分泌的效應蛋白也成千上萬，誰具有切割線性泛素鏈的去泛素化酶活性呢?

朱永群團隊設計了一個“簡單”卻很“新穎”的實驗。

此前，他們研究發(fā)現(xiàn)，病原菌只有與宿主細胞接觸時才會分泌“毒素”。而事實上，當病原菌生活在營養(yǎng)充足并開始快速生長的后對數(shù)生長期時，效應蛋白就已經(jīng)被表達了，只不過尚未分泌出來而已。

由于泛素和泛素鏈只存在于真核生物中，研究人員設想，如果將病原菌培養(yǎng)到后對數(shù)生長期，將其制備成細菌裂解液，然后利用它在體外切割泛素鏈。“病原菌細胞裂解后，效應蛋白釋放在試管中，如果裂解液能夠?qū)⒎核劓溓懈畛蓡蝹€泛素分子，表明該細菌裂解液具有去泛素化酶的活性。”朱永群說。

隨后研究人員根據(jù)這一設想建立了實驗體系，利用這一篩選體系，對43種不同的病原菌進行篩選，成功發(fā)現(xiàn)嗜肺軍團菌的裂解液能夠切割線性泛素鏈，表明嗜肺軍團菌含有切割線性泛素鏈去泛素化酶活性的效應蛋白。

“這很有意思。”朱永群說。嗜肺軍團菌就是人類“空調(diào)病”的病原菌，它常存在于空調(diào)的冷凝水中，被人呼吸到肺部后，就會在肺部里面‘干壞事’。它分泌300個毒性效應蛋白到宿主細胞中，在巨噬細胞內(nèi)，嗜肺軍團菌建立了獨特的膜泡結(jié)構(gòu)作為“大本營”，在里面大量增殖，最后導致巨噬細胞死亡，被釋放出來的細菌再進行新一輪的感染。“當巨噬細胞死亡的越來越多，就會引發(fā)‘空調(diào)病’。”

然而，究竟是嗜肺軍團菌中哪個效應蛋白切割的線性泛素鏈?研究人員從該菌中克隆了149個功能未知效應蛋白，在體外進行針對線性泛素鏈的去泛素化酶活性實驗，成功篩選出唯一的一個名為RavD效應蛋白。隨后的實驗表明，RavD只特異地切割線性泛素鏈，對其它類型的泛素鏈不起作用。

一種新工具

“RavD效應蛋白是一個全新的去泛素化酶。”朱永群表示，通過解析它的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)RavD具有獨特的三維結(jié)構(gòu)，不同于先前發(fā)現(xiàn)的所有去泛素化酶。

更重要的是，研究人員發(fā)現(xiàn)RavD被嗜肺軍團菌分泌后，會持續(xù)性地切割膜泡上形成的線性泛素鏈，避免膜泡上線性泛素鏈的累積，達到抑制宿主NF-κB免疫信號的目的。這樣的結(jié)果導致，已被感染的細胞無法發(fā)出“求救信號”，處于一種仍然“健康”的假象中。

事實上，不止是在嗜肺軍團菌中，RavD廣泛存在于軍團菌屬細菌中。

與前述爭議較大的OTULIN不同，RavD有望被開發(fā)成研究線性泛素鏈的全新工具，促進真核細胞信號轉(zhuǎn)導的研究。

“未來，我們希望對我們發(fā)現(xiàn)的獨特效應蛋白進行蛋白工程上的改造，使它們能成為生物醫(yī)學研究和臨床診治的工具。對于一些感染至關重要的效應蛋白，我們希望能幫助研發(fā)新型抗菌藥物，解決日益嚴重的病原菌耐藥性問題。”朱永群說。(韓揚眉)

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